Komponenten von Lysis-Puffer

Komponenten von Lysis-Puffer

Lyse ist ein Wort, das aus dem Griechischen stammt und lediglich "spalten" oder "platzen" bedeutet. Es ist eine angemessene Beschreibung dessen, was mit Zellen in einem Lysepuffer passiert, eine L√∂sung, die sie aufbricht, um ihren Inhalt zu extrahieren. Wissenschaftler verwenden Lysis-Puffer, wenn sie DNA oder Proteine ‚Äč‚Äčaus Zellen zur Analyse extrahieren, insbesondere im Fall von Bakterien. Die Art des Zell-Lyse-Puffers variiert in Abh√§ngigkeit von der Art des Experiments, obwohl das Folgende einige √ľbliche Auswahlm√∂glichkeiten sind.

Puffer und Salz

Puffer stabilisieren den pH w√§hrend die Zellen lysiert werden. Tris-HCL ist ein √ľblicher Puffer zur Pufferung bei pH 8; Wenn ein pH-Wert erw√ľnscht ist, ist HEPES eine weitere √ľbliche Pufferchemikalie in diesen Experimenten. Natriumchloridsalz kann ebenfalls enthalten sein, um die Ionenst√§rke, die Gesamtkonzentration von gel√∂sten Stoffen au√üerhalb der Zellen, zu erh√∂hen. Letzteres ist wichtig, da Wasser √ľber Zellmembranen von Regionen mit geringer Konzentration an gel√∂sten Stoffen zu Regionen mit hoher Konzentration an gel√∂sten Stoffen diffundieren kann.

Waschmittel

Reinigungsmittel ist der Hauptbestandteil, der die Zellmembran aufl√∂st, so dass der Inhalt entweichen kann. Detergentien sind amphipathische Molek√ľle, d. H. Molek√ľle mit einem Ende, das leicht mit Wassermolek√ľlen wechselwirkt, w√§hrend das andere hydrophobe oder "wasserfreundliche" Ende dies nicht tut. Sie k√∂nnen Fette aufl√∂sen, indem sie Micellen bilden, kleine Cluster, in denen die hydrophoben Schw√§nze der Detergensmolek√ľle nach innen zu den Fettmolek√ľlen zeigen. √úbliche Detergentien umfassen Natriumdodecylsulfat oder SDS, NP-40 und TritonX.

Chelatbildner und Inhibitoren

Lysepuffer umfassen typischerweise auch Chelatbildner wie Ethylendiamintetraessigs√§ure (EDTA) oder Ethylenglykoltetraessigs√§ure (EGTA). Diese Chemikalien binden an Metallionen mit einer Ladung +2 (z. B. Magnesium und Calcium), wodurch sie f√ľr andere Reaktionen nicht verf√ľgbar sind. Viele DNAsen (Proteine, die DNA aufspalten) und Proteasen (Proteine, die andere Proteine ‚Äč‚Äčaufspalten) ben√∂tigen Magnesiumionen, um zu funktionieren. EDTA und EGTA entziehen ihnen daher diesen Schl√ľsselbestandteil und tragen so dazu bei, die Protease- oder DNAse-Aktivit√§t zu reduzieren. Sie schlie√üen es jedoch nicht vollst√§ndig aus, und einige Proteasen sind nicht von Magnesium-Cofaktoren abh√§ngig, so dass Lysepuffer manchmal auch Chemikalien enthalten, die Proteaseinhibitoren genannt werden, die an Proteasen binden und sie daran hindern, richtig zu funktionieren.

Alkalische Lysis

Alkalische Lyse ist eine sehr √ľbliche Technik zur Reinigung von Plasmiden aus Bakterien. Diese Methode beinhaltet drei L√∂sungen. Die erste enth√§lt Glucose, Tris-HCL-Puffer, EDTA und RNAsen. Die Glukose erzeugt eine hohe Konzentration an gel√∂sten Stoffen au√üerhalb der Bakterien, so dass sie etwas schlaff werden, wodurch sie leichter zu lysieren sind; Die EDTA- und Tris-HCL-Funktion funktioniert wie bereits beschrieben, w√§hrend die RNAse jede RNA innerhalb der Zelle kaut, um sie aus dem Weg zu r√§umen. Die zweite L√∂sung lysiert tats√§chlich die Zellen. Dieser enth√§lt SDS-Detergens und NaOH, die den pH-Wert auf 12 oder h√∂her erh√∂hen, Proteine ‚Äč‚Äčin der Zelle denaturieren und DNA in einzelne Str√§nge trennen. Die dritte L√∂sung enth√§lt Kaliumacetat, um den pH auf ein neutraleres Niveau zu bringen, so dass die Plasmid-DNA-Str√§nge wieder zusammenkommen k√∂nnen. In der Zwischenzeit klumpen die denaturierten Proteine ‚Äč‚Äčauf und fallen aus, w√§hrend die Dodecylsulfationen mit den Kaliumionen zu einer unl√∂slichen Verbindung zusammenkommen, die ebenfalls aus der L√∂sung ausf√§llt.

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