Die Vorteile der Verwendung von Sticky-End-Enzymen

Die Vorteile der Verwendung von Sticky-End-Enzymen

Molekulares Klonen ist eine gĂ€ngige biotechnologische Methode, mit der jeder Student und Forscher vertraut sein sollte. Molekulares Klonieren unter Verwendung eines Enzymtyps, der als Restriktionsenzym bezeichnet wird, um menschliche DNA in Fragmente zu schneiden, die dann in die Plasmid-DNA einer Bakterienzelle insertiert werden können. Restriktionsenzyme schneiden doppelstrĂ€ngige DNA in zwei HĂ€lften. AbhĂ€ngig von dem Restriktionsenzym kann der Schnitt entweder zu einem klebrigen Ende oder zu einem stumpfen Ende fĂŒhren. Klebrige Enden sind beim molekularen Klonieren nĂŒtzlicher, da sie sicherstellen, dass das menschliche DNA-Fragment in der richtigen Richtung in das Plasmid eingefĂŒgt wird. Der Ligationsprozess oder das Fusionieren von DNA-Fragmenten erfordert weniger DNA, wenn die DNA klebrige Enden aufweist. Schließlich können mehrere Restriktionsenzyme mit klebrigen Enden das gleiche klebrige Ende erzeugen, obwohl jedes Enzym eine andere Restriktionssequenz erkennt. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass Ihre DNA-Region von Interesse durch klebrige End-Enzyme ausgeschnitten werden kann.

Restriktionsenzyme und Restriktionsstellen

Restriktionsenzyme sind Enzyme, die spezifische Sequenzen an doppelstrÀngiger DNA schneiden und die DNA in dieser Sequenz halbieren. Die erkannte Sequenz wird als Restriktionsstelle bezeichnet. Restriktionsenzyme werden Endonukleasen genannt, weil sie an Stellen, die sich zwischen den Enden der DNA befinden, doppelstrÀngige DNA schneiden, so wie die DNA normalerweise existiert. Es gibt mehr als 90 verschiedene Restriktionsenzyme. Jeder erkennt eine bestimmte Restriktionsstelle. Restriktionsenzyme spalten ihre jeweiligen Restriktionsstellen 5.000 Mal effizienter als andere Stellen, die sie nicht erkennen.

Die richtige Orientierung

Restriktionsenzyme gibt es in zwei allgemeinen Klassen. Sie schneiden DNA entweder in klebrige Enden oder stumpfe Enden. Ein klebriges Ende hat eine kurze Region von Nukleotiden, die Bausteine ​​der DNA, die ungepaart sind. Diese ungepaarte Region wird als Überhang bezeichnet. Der Überhang wird als klebrig bezeichnet, da er mit einem anderen klebrigen Ende, das eine komplementĂ€re Überhangsequenz hat, koppeln will und wird. Klebrige Enden sind wie lang verlorene Zwillinge, die sich strammen, wenn sie sich treffen. Auf der anderen Seite sind stumpfe Enden nicht klebrig, weil alle Nukleotide bereits zwischen den zwei DNA-StrĂ€ngen gepaart sind. Der Vorteil von klebrigen Enden besteht darin, dass ein Fragment menschlicher DNA nur in einer Richtung in ein bakterielles Plasmid passen kann. Wenn im Gegensatz dazu sowohl die menschliche DNA als auch das bakterielle Plasmid stumpfe Enden haben, kann die humane DNA Kopf-an-Schwanz oder Schwanz-an-Kopf in das Plasmid eingefĂŒgt werden.

Ligating Sticky Ends benötigt weniger DNA

Obwohl DNA mit Stockenden sich aufgrund ihrer "Klebrigkeit" leichter finden kann, können sich weder klebrige Enden noch stumpfe Enden zu einem kontinuierlichen DNA-StĂŒck verbinden. Die Bildung eines kontinuierlichen StĂŒcks DNA, das vollstĂ€ndig verknĂŒpft ist, erfordert ein Enzym, das Ligase genannt wird. Ligasen verbinden die RĂŒckgrate von Nukleotiden an den klebrigen oder stumpfen Enden, was zu einer kontinuierlichen Kette von Nukleotiden fĂŒhrt. Da sich klebrige Enden aufgrund ihrer gegenseitigen Anziehung schneller finden, erfordert der Ligierungsprozess weniger menschliche DNA und weniger Plasmid-DNA. Die glatten Enden von DNA und Plasmiden sind weniger wahrscheinlich, um einander zu finden, und somit erfordert die Ligation stumpfer Enden, dass mehr DNA in das Teströhrchen gegeben wird.

Verschiedene Enzyme können das gleiche klebrige Ende geben

Restriktionsstellen befinden sich im gesamten Genom von Organismen, sind jedoch nicht gleichmĂ€ĂŸig verteilt. In Plasmiden können sie so konstruiert werden, dass sie direkt nebeneinander liegen. Wissenschaftler, die ein Fragment menschlicher DNA aus dem menschlichen Genom herausschneiden wollen, mĂŒssen Restriktionsstellen finden, die sich vor und hinter der Region des Fragments befinden. ZusĂ€tzlich zur GewĂ€hrleistung, dass ein DNA-Fragment in die richtige Richtung eingefĂŒgt wird, können verschiedene klebrige Endenzyme das gleiche klebrige Ende erzeugen, obwohl sie unterschiedliche Restriktionssequenzen erkennen. Zum Beispiel haben BamHI, BglII und Sau3A unterschiedliche Erkennungssequenzen, erzeugen aber das gleiche klebrige GATC-Ende. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass es klebrige End-Restriktionsstellen gibt, die Ihr menschliches Gen von Interesse flankieren.

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