Die Vorteile der Verwendung von Sticky-End-Enzymen

Die Vorteile der Verwendung von Sticky-End-Enzymen

Molekulares Klonen ist eine g√§ngige biotechnologische Methode, mit der jeder Student und Forscher vertraut sein sollte. Molekulares Klonieren unter Verwendung eines Enzymtyps, der als Restriktionsenzym bezeichnet wird, um menschliche DNA in Fragmente zu schneiden, die dann in die Plasmid-DNA einer Bakterienzelle insertiert werden k√∂nnen. Restriktionsenzyme schneiden doppelstr√§ngige DNA in zwei H√§lften. Abh√§ngig von dem Restriktionsenzym kann der Schnitt entweder zu einem klebrigen Ende oder zu einem stumpfen Ende f√ľhren. Klebrige Enden sind beim molekularen Klonieren n√ľtzlicher, da sie sicherstellen, dass das menschliche DNA-Fragment in der richtigen Richtung in das Plasmid eingef√ľgt wird. Der Ligationsprozess oder das Fusionieren von DNA-Fragmenten erfordert weniger DNA, wenn die DNA klebrige Enden aufweist. Schlie√ülich k√∂nnen mehrere Restriktionsenzyme mit klebrigen Enden das gleiche klebrige Ende erzeugen, obwohl jedes Enzym eine andere Restriktionssequenz erkennt. Dies erh√∂ht die Wahrscheinlichkeit, dass Ihre DNA-Region von Interesse durch klebrige End-Enzyme ausgeschnitten werden kann.

Restriktionsenzyme und Restriktionsstellen

Restriktionsenzyme sind Enzyme, die spezifische Sequenzen an doppelsträngiger DNA schneiden und die DNA in dieser Sequenz halbieren. Die erkannte Sequenz wird als Restriktionsstelle bezeichnet. Restriktionsenzyme werden Endonukleasen genannt, weil sie an Stellen, die sich zwischen den Enden der DNA befinden, doppelsträngige DNA schneiden, so wie die DNA normalerweise existiert. Es gibt mehr als 90 verschiedene Restriktionsenzyme. Jeder erkennt eine bestimmte Restriktionsstelle. Restriktionsenzyme spalten ihre jeweiligen Restriktionsstellen 5.000 Mal effizienter als andere Stellen, die sie nicht erkennen.

Die richtige Orientierung

Restriktionsenzyme gibt es in zwei allgemeinen Klassen. Sie schneiden DNA entweder in klebrige Enden oder stumpfe Enden. Ein klebriges Ende hat eine kurze Region von Nukleotiden, die Bausteine ‚Äč‚Äčder DNA, die ungepaart sind. Diese ungepaarte Region wird als √úberhang bezeichnet. Der √úberhang wird als klebrig bezeichnet, da er mit einem anderen klebrigen Ende, das eine komplement√§re √úberhangsequenz hat, koppeln will und wird. Klebrige Enden sind wie lang verlorene Zwillinge, die sich strammen, wenn sie sich treffen. Auf der anderen Seite sind stumpfe Enden nicht klebrig, weil alle Nukleotide bereits zwischen den zwei DNA-Str√§ngen gepaart sind. Der Vorteil von klebrigen Enden besteht darin, dass ein Fragment menschlicher DNA nur in einer Richtung in ein bakterielles Plasmid passen kann. Wenn im Gegensatz dazu sowohl die menschliche DNA als auch das bakterielle Plasmid stumpfe Enden haben, kann die humane DNA Kopf-an-Schwanz oder Schwanz-an-Kopf in das Plasmid eingef√ľgt werden.

Ligating Sticky Ends benötigt weniger DNA

Obwohl DNA mit Stockenden sich aufgrund ihrer "Klebrigkeit" leichter finden kann, k√∂nnen sich weder klebrige Enden noch stumpfe Enden zu einem kontinuierlichen DNA-St√ľck verbinden. Die Bildung eines kontinuierlichen St√ľcks DNA, das vollst√§ndig verkn√ľpft ist, erfordert ein Enzym, das Ligase genannt wird. Ligasen verbinden die R√ľckgrate von Nukleotiden an den klebrigen oder stumpfen Enden, was zu einer kontinuierlichen Kette von Nukleotiden f√ľhrt. Da sich klebrige Enden aufgrund ihrer gegenseitigen Anziehung schneller finden, erfordert der Ligierungsprozess weniger menschliche DNA und weniger Plasmid-DNA. Die glatten Enden von DNA und Plasmiden sind weniger wahrscheinlich, um einander zu finden, und somit erfordert die Ligation stumpfer Enden, dass mehr DNA in das Testr√∂hrchen gegeben wird.

Verschiedene Enzyme können das gleiche klebrige Ende geben

Restriktionsstellen befinden sich im gesamten Genom von Organismen, sind jedoch nicht gleichm√§√üig verteilt. In Plasmiden k√∂nnen sie so konstruiert werden, dass sie direkt nebeneinander liegen. Wissenschaftler, die ein Fragment menschlicher DNA aus dem menschlichen Genom herausschneiden wollen, m√ľssen Restriktionsstellen finden, die sich vor und hinter der Region des Fragments befinden. Zus√§tzlich zur Gew√§hrleistung, dass ein DNA-Fragment in die richtige Richtung eingef√ľgt wird, k√∂nnen verschiedene klebrige Endenzyme das gleiche klebrige Ende erzeugen, obwohl sie unterschiedliche Restriktionssequenzen erkennen. Zum Beispiel haben BamHI, BglII und Sau3A unterschiedliche Erkennungssequenzen, erzeugen aber das gleiche klebrige GATC-Ende. Dies erh√∂ht die Wahrscheinlichkeit, dass es klebrige End-Restriktionsstellen gibt, die Ihr menschliches Gen von Interesse flankieren.

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